研究背景
干旱是影響全球農(nóng)作物產(chǎn)量的一種主要非生物脅迫。目前，通過基因工程的手段構(gòu)建抗旱轉(zhuǎn)基因作物成為應(yīng)對干旱脅迫的一種重要方法。其中，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物抗旱性的一種策略是，將調(diào)控非生物學(xué)脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄因子引進(jìn)轉(zhuǎn)基因抗旱作物。一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子家族AP2（），其亞家族是報道的參與非生物脅迫的早期響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，主要包含一個AP2結(jié)構(gòu)域，在低溫或者缺水條件下可以結(jié)合到靶基因的或脫水響應(yīng)元件（，DRE）上。已有的報道顯示，一些過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性和抗凍性。
丹參是一種傳統(tǒng)的中藥植物，它的根對于高血脂、腦血管和心血管疾病有很好的療效。目前，隨著環(huán)境條件日益惡劣，尤其是全球變暖帶來的干旱氣候，造成丹參種植范圍的縮小和產(chǎn)量的嚴(yán)重下降。因此，提高丹參適應(yīng)脅迫尤其是干旱脅迫的能力有著非常重要的實(shí)際價值。但是，目前通過基因工程改造丹參的研究方向主要聚焦在提高其藥用活性成分（如丹參酮）的含量，幾乎沒有研究應(yīng)用基因工程來改善丹參適應(yīng)脅迫的能力。本研究通過在丹參中異源表達(dá)擬南芥的來改善其抗旱性，并通過表型觀察和生理學(xué)研究、轉(zhuǎn)錄組測序分析解析相關(guān)抗旱分子機(jī)制。
材料方法
1、實(shí)驗材料：
分別選取3株干旱處理6天的51天大小的丹參：p35S::（組成性啟動子驅(qū)動擬南芥基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因丹參）、::（脅迫誘導(dǎo)啟動子驅(qū)動擬南芥基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因丹參）和WT（野生型丹參），提取RNA，等量混合后構(gòu)建cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。
2、測序方法及數(shù)據(jù)量：
：，每個樣品約5G數(shù)據(jù)量。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
1、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物
為了研究擬南芥基因在丹參中的作用，構(gòu)建了兩種轉(zhuǎn)基因丹參：p35S::和::。其中p35S::是在組成性啟動子驅(qū)動下，而::則是在脅迫誘導(dǎo)啟動子驅(qū)動下。分別用PCR和RT-PCR對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行了驗證，從中分別篩選了4個轉(zhuǎn)基因line用于后續(xù)研究：p35S::-01和04，::-02和07。
2、轉(zhuǎn)基因丹參中表達(dá)模式
用RT-PCR方法檢測在外源ABA處理和各種脅迫處理條件下，轉(zhuǎn)基因丹參中的表達(dá)情況。實(shí)驗結(jié)果顯示，無論是在對照組還是處理組，在p35S::的兩個中，都呈現(xiàn)出較高的表達(dá)量；而在::的兩個中，在對照組表達(dá)量非常低，在處理組受到很強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)。
3、轉(zhuǎn)基因丹參的表型變化和抗旱性分析
通過觀察正常生長條件下轉(zhuǎn)基因丹參、野生型（WT）、轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨ㄞD(zhuǎn)化空載體），發(fā)現(xiàn)p35S::的兩個比對照植物生長緩慢，而::的兩個生長并沒有受到影響。p35S::植物株高比WT矮三分之一，葉片顏色變深，葉片較短較小。
通過觀察在干旱處理條件下轉(zhuǎn)基因丹參和WT的表型，從而檢測在丹參中表達(dá)是否能增強(qiáng)抗旱性。在干旱處理早期（處理3天），所有植物都表現(xiàn)出正常生長狀態(tài)。在干旱處理6天時，WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏娜~片迅速萎蔫，而轉(zhuǎn)基因丹參則沒有變化。在干旱處理9天時，WT和對照植物嚴(yán)重萎蔫，而轉(zhuǎn)基因丹參幾乎沒有變化。在干旱處理晚期（處理11天），所有的植物，包括轉(zhuǎn)基因丹參，都表現(xiàn)出嚴(yán)重的萎蔫。在恢復(fù)供水以后，轉(zhuǎn)基因丹參p35S::和::都迅速恢復(fù)了，而WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ談t不能恢復(fù)生長，最終死亡。
圖1轉(zhuǎn)基因丹參表型分析
4、異源表達(dá)可降低干旱脅迫下ROS的積累
一般干旱脅迫會引起植物ROS的積累，因此分析在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因丹參是否可以減少ROS的積累。通過NBT和DAB染色方法檢測干旱脅迫下植物體內(nèi)O2-和H2O2。在正常生長條件下，WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩紱]有檢測到NBT染色，在干旱處理下，可以看到明顯的NBT染色。但是即使在干旱脅迫下，在轉(zhuǎn)基因丹參中也沒有檢測到NBT染色。此外，相對WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨D(zhuǎn)基因丹參中也沒有檢測到明顯的DAB染色。O2-和H2O2的定量分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因丹參中ROS含量顯著性低于WT。
圖2WT和轉(zhuǎn)基因丹參葉片中O2-和H2O2分析
5、表達(dá)影響MDA含量和SOD、POD、CAT活性
我們還檢測了在WT和轉(zhuǎn)基因丹參葉片中一個脂質(zhì)過氧化作用的標(biāo)志物質(zhì)MDA的含量。在干旱處理9天時，轉(zhuǎn)基因丹參中MDA含量明顯低于WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡＿M(jìn)一步通過檢測SOD、POD和CAT（清除脅迫時植物積累的有害ROS的抗氧化酶）的活性來分析轉(zhuǎn)基因丹參的抗旱機(jī)制。分析結(jié)果顯示，在9天干旱處理過程中，這些抗氧化酶的活性在各植物中趨勢類似。在轉(zhuǎn)基因丹參中，所有抗氧化酶的活性都要顯著高于WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡＿@些結(jié)果說明，轉(zhuǎn)基因丹參的抗旱性增強(qiáng)可能與其減少的MDA含量和增強(qiáng)的抗氧化酶活性相關(guān)。
6、過表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因丹參中RWC和葉綠體含量
我們檢測了干旱處理9天時植物體內(nèi)的RWC和葉綠素含量。轉(zhuǎn)基因丹參的RWC含量高于WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨琾35S::和::之間沒有顯著差別。轉(zhuǎn)基因丹參的葉綠色含量也顯著高于WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨琾35S::的葉綠色含量最高。
7、干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因丹參光合作用能力增強(qiáng)
為了評估轉(zhuǎn)基因丹參的光合作用能力，我們用-2方法檢測干旱處理下植物的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（E）和葉片的氣孔導(dǎo)度（gs）。正常生長條件下，在所有材料中這些值均沒有顯著差異。在干旱處理下，WT和轉(zhuǎn)基因?qū)φ誔n、E和gs值都顯著下降，但是轉(zhuǎn)基因丹參的受到的影響沒這么大。在干旱處理9天時，這些參數(shù)差異最顯著，但是p35S::和::沒有顯著差別。
8、干旱脅迫下過表達(dá)轉(zhuǎn)基因丹參轉(zhuǎn)錄組測序分析
為了進(jìn)一步解析轉(zhuǎn)基因丹參抗旱的分子機(jī)制，我們通過對p35S::、::和WT進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)而分析轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)變化。對p35S::、::和WT，分別提取3株干旱處理6天的51天大小植物提取RNA，等量混合后構(gòu)建cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到13,153,489條，161,844個轉(zhuǎn)錄本和73,748個。
通過對1,970個差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，其中704個差異基因在兩個差異分組（::，::）中表達(dá)都類似。相對WT，在p35S::中629個上調(diào)351個下調(diào)表達(dá)，在::中1,148上調(diào)378個下調(diào)表達(dá)。相對于p35S::，在::中342上調(diào)101個下調(diào)表達(dá)。
為了對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，選擇了30個差異表達(dá)基因（18個上調(diào)，12個下調(diào)）進(jìn)行定量RT-PCR實(shí)驗驗證。實(shí)驗結(jié)果顯示，基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測序基因表達(dá)模式相類似。相關(guān)性分析顯示，RNA測序數(shù)據(jù)和qRT-PCR數(shù)據(jù)之間呈現(xiàn)較高的相關(guān)性（R2〉0.98），這進(jìn)一步驗證了RNA測序數(shù)據(jù)的可靠性。
圖3WT和轉(zhuǎn)基因丹參的差異基因聚類分析
圖4兩組差異分組（::::）韋恩圖
9、差異表達(dá)基因的COG富集和KEGG通路分析
通過對DEGs在COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和分類分析，基于注釋在COG每個分類中的基因數(shù)目進(jìn)行排名，發(fā)現(xiàn)在兩個差異分組的DEGs中，“轉(zhuǎn)錄本”和“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”都排在前三類中。這說明在這兩個分類中的差異基因在轉(zhuǎn)基因丹參抗旱中發(fā)揮重要作用。
我們還用KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs進(jìn)行基因功能和調(diào)控通路分析。分別獲取了兩個差異分組（::，::）的KEGG富集的前50個代謝通路。在兩組中均富集的KEGG通路有光合作用、
植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體、苯丙素生物合成。其中植物激素調(diào)控途徑分別位于兩個差異分組KEGG富集結(jié)果的第二和第四。具體分析各植物激素途徑發(fā)現(xiàn)，生長素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸和水楊酸的途徑中，兩個差異分組的DEGs均上調(diào)表達(dá)；乙烯途徑中的差異基因則表現(xiàn)出混合表達(dá)模式，如ERF1/2；脫落酸途徑中的差異基因表現(xiàn)出各種表達(dá)模式，如在p35S::中PP2C下調(diào)上調(diào)，在::中PP2C為混合表達(dá)模式，PYR/PYL和上調(diào)。
圖5差異基因的COG和KEGG分類分析
此外，還分析了干旱處理下p35S::和::的差異基因DEGs。根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫注釋，約15%的DEGs為“次生代謝生物合成轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝”。KEGG富集結(jié)果顯示，“苯丙氨酸代謝”和“苯丙素生物合成”位于前兩位。相對于p35S::，大多數(shù)DEGs在::中上調(diào)表達(dá)。
圖6植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相差異基因的KEGG通路分析
創(chuàng)新點(diǎn)
1、丹參是一種傳統(tǒng)的中藥植物，它的根對于高血脂、腦血管和心血管疾病有很好的療效。提高丹參適應(yīng)脅迫尤其是干旱脅迫的能力有著非常重要的實(shí)際價值。
2、目前通過基因工程改造丹參的研究方向主要聚焦在提高其藥用活性成分（如丹參酮）的含量，幾乎沒有研究應(yīng)用基因工程來改善丹參適應(yīng)脅迫的能力。本研究通過在丹參中異源表達(dá)擬南芥的來改善其抗旱性。
3、表型數(shù)據(jù)豐富，文章分別從植物形態(tài)、ROS含量、MAD含量、清除ROS的酶（CAT等）、光合作用相關(guān)參數(shù)、RWC和葉綠體含量，分析比較了轉(zhuǎn)基因丹參和WT的抗旱性。
4、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析緊密與抗旱的表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，從DEGs的COG和KEGG注釋和富集分析的結(jié)果來解析轉(zhuǎn)基因丹參抗旱的分子機(jī)制。
參考文獻(xiàn)
[J].nce，2017.
